(1)

Regulamentul delegat (UE) 2016/1238 al Comisiei (²) și Regulamentul de punere în aplicare (UE) 2016/1240 (³) al Comisiei stabilesc norme în ceea ce privește intervenția publică și ajutoarele pentru depozitarea privată. Regulamentul (CE) nr. 273/2008 al Comisiei (⁴) stabilește metodele care trebuie aplicate pentru a se evalua dacă laptele și produsele lactate îndeplinesc cerințele de eligibilitate prevăzute în regulamentele menționate, referitoare la intervenția publică și la ajutoarele pentru depozitarea privată.

(2)

Având în vedere evoluțiile tehnice ale metodologiei utilizate pentru analiza și evaluarea calitativă a laptelui și produselor lactate, ar trebui aduse modificări substanțiale în scopul simplificării și al furnizării unor referiri actualizate la standardele ISO. Din motive de claritate și eficiență și având în vedere amploarea și natura tehnică a modificărilor aduse dispozițiilor Regulamentului (CE) nr. 273/2008, dispozițiile relevante ale regulamentului respectiv ar trebui încorporate în Regulamentul de punere în aplicare (UE) 2016/1240.

(3)

Pentru a se asigura respectarea uniformă a noilor standarde și metode în toate statele membre, ar trebui să se acorde laboratoarelor o perioadă de timp suficientă pentru revizuirea procedurilor și aplicarea metodelor actualizate.

(4)

Prin urmare, Regulamentul de punere în aplicare (UE) 2016/1240 ar trebui modificat în consecință.

(5)

Din motive de securitate juridică, Regulamentul (CE) nr. 273/2008 ar trebui abrogat.

(6)

Măsurile prevăzute în prezentul regulament sunt conforme cu avizul Comitetului pentru organizarea comună a piețelor agricole,

1.

Articolul 4 se modifică după cum urmează:

2.

Se introduce următorul articol 60a:

„Articolul 60a

Dispoziții specifice privind controalele legate de intervenția publică și de ajutoarele pentru depozitarea privată a laptelui și produselor lactate

(1)   Eligibilitatea untului, a laptelui praf degresat și a brânzei pentru care urmează a se primi ajutor pentru depozitarea privată se stabilește în conformitate cu metodele prevăzute în anexele VI, VII și, respectiv, VIII.

Metodele respective se stabilesc prin referire la cele mai recente versiuni ale standardelor europene sau internaționale relevante, după caz, aflate în vigoare de cel puțin 6 luni înainte de prima zi a perioadei de intervenție publică stabilite la articolul 12 din Regulamentul (UE) nr. 1308/2013.

(2)   Rezultatele verificărilor efectuate prin aplicarea metodelor prevăzute în prezentul regulament se evaluează în conformitate cu anexa IX.”

3.

Anexele se modifică în conformitate cu anexa la prezentul regulament.

1.

Anexa IV se modifică după cum urmează:

2.

În anexa V se introduce următoarea parte Ia:

„PARTEA IA

Metode de analiză a laptelui praf degresat pentru intervenție publică

Apendicele I

LAPTE PRAF DEGRESAT: DETERMINAREA CANTITATIVĂ A FOSFATIDILSERINEI ȘI A FOSFATIDILETANOLAMINEI

Metodă: HPLC în fază inversă

1.   OBIECTIV ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Metoda descrie o procedură de determinare cantitativă a fosfatidilserinei (PS) și a fosfatidiletanolaminei (PE) din laptele praf degresat (SMP) și este adecvată pentru determinarea substanțelor solide din zară în SMP.

2.   DEFINIȚIE

Conținut PS + PE: fracțiunea masică a substanței determinată prin procedura specificată aici. Rezultatul se exprimă în miligrame de dipalmitoil fosfatidiletanolamină (PEDP) per 100 g de praf.

3.   PRINCIPIUL METODEI

Extracția aminofosfolipidelor cu metanol din lapte praf reconstituit. Determinarea PS și a PE ca derivați ai o-ftaldialdehidei (OPA) prin HPLC în fază inversă (RP) și prin detectare cu fluorescență. Cuantificarea conținutului de PS și de PE din proba de testat prin referire la o probă-standard conținând o cantitate cunoscută de PEDP.

4.   REACTIVI

Toți reactivii sunt de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puțin echivalentă, cu excepția cazurilor în care se specifică altfel.

4.1.   Material-standard: PEDP cu o puritate de cel puțin 99 %

Notă: Materialul-standard se depozitează la – 18 °C.

4.2.   Reactivi pentru prepararea probei-standard și a probei de testat

4.2.1.   Metanol de calitate HPLC

4.2.2.   Cloroform de calitate HPLC

4.2.3.   Monoclorhidrat de triptamină

4.3.   Reactivi pentru derivarea o-ftaldialdehidei

4.3.1.   Hidroxid de sodiu, soluție apoasă 12 M

4.3.2.   Acid boric, soluție apoasă 0,4 M ajustată la pH de 10,0 cu hidroxid de sodiu (4.3.1)

4.3.3.   2-mercaptoetanol

4.3.4.   o-ftaldialdehidă (OPA)

4.4.   Solvenți de eluție HPLC

4.4.1.   Solvenții de eluție se prepară utilizând reactivi de calitate HPLC.

4.4.2.   Apă de calitate HPLC

4.4.3.   Metanol cu puritate fluorimetrică testată

4.4.4.   Tetrahidrofuran

4.4.5.   Fosfat diacid de sodiu

4.4.6.   Acetat de sodiu

4.4.7.   Acid acetic.

5.   APARATURĂ

5.1.   Cântar analitic, capabil să cântărească până la cea mai apropiată valoare de 1 mg, cu lizibilitate de 0,1 mg

5.2.   Pahare Berzelius, cu capacitate de 25 și 100 ml

5.3.   Pipete, capabile să dozeze 1 și 10 ml

5.4.   Agitator magnetic

5.5.   Pipete gradate, capabile să dozeze 0,2, 0,5 și 5 ml

5.6.   Flacoane gradate, cu capacitate de 10, 50 și 100 ml

5.7.   Seringi, cu capacitate de 20 și 100 μl

5.8.   Baie cu ultrasunete

5.9.   Centrifugă, capabilă să funcționeze la 27 000 × g

5.10.   Fiole de sticlă, cu capacitate de aproximativ 5 ml

5.11.   Cilindru gradat, cu capacitate de 25 ml

5.12.   pH-metru, cu precizie de 0,1 unități de pH

5.13.   Echipament HPLC

5.13.1.   Sistem de pompare pe bază de gradient, capabil să funcționeze la 1,0 ml/min la 200 bari

5.13.2.   Aparat de prelevare de probe automată cu posibilitate de derivare

5.13.3.   Încălzitor cu coloană, capabil să mențină coloana la 30 °C ± 1 °C

5.13.4.   Detector cu fluorescență, capabil să funcționeze la o lungime de undă de excitație de 330 nm și la o lungime de undă de emisie de 440 nm

5.13.5.   Integrator sau software de procesare de date capabil să măsoare aria vârfului

5.13.6.   O coloană LiChrospher® – 100 (250 × 4,6 mm) sau o coloană echivalentă umplută cu octadecilsilan (C 18), particule de 5 μm.

6.   PRELEVAREA PROBELOR

Prelevarea probelor se realizează în conformitate cu standardul ISO 707.

7.   PROCEDURA

7.1.   Prepararea soluției-standard interne

7.1.1.   Se cântăresc 30,0 ± 0,1 mg de monoclorhidrat de triptamină (4.2.3) într-un flacon gradat de 100 ml (5.6) și se completează până la marcaj cu metanol (4.2.1).

7.1.2.   Se pipetează 1 ml (5.3) din această soluție într-un flacon gradat de 10 ml (5.6) și se completează până la marcaj cu metanol (4.2.1) pentru a se obține o concentrație de triptamină de 0,15 mM

7.2.   Prepararea soluției conținând proba de testat

7.2.1.   Se cântăresc 1,000 ± 0,001 g de probă de SMP într-un pahar Berzelius de 25 ml (5.2). Se adaugă 10 ml de apă distilată cu temperatura de 40 °C ± 1 °C cu o pipetă (5.3) și se amestecă cu un agitator magnetic (5.4) timp de 30 de minute pentru a se dizolva orice concrețiuni.

7.2.2.   Se pipetează 0,2 ml (5.5) din laptele reconstituit într-un flacon gradat de 10 ml (5.6), se adaugă 100 μl din soluția de triptamină de 0,15 mM (7.1) cu ajutorul unei seringi (5.7) și se completează până la volum cu metanol (4.2.1). Se amestecă cu grijă prin răsturnare și se expune ultrasunetelor (5.8) timp de 15 min

7.2.3.   Se centrifughează (5.9) la 27 000 × g timp de 10 minute și se colectează supernatantul într-o fiolă de sticlă (5.10)

Notă: Soluția conținând proba de testat se depozitează la 4 °C până la finalizarea analizei HPLC.

7.3.   Prepararea soluției-standard externe

7.3.1.   Se cântăresc 55,4 g de PEDP (4.1) într-un flacon gradat de 50 ml (5.6) și se adaugă aproximativ 25 ml de cloroform (4.2.2) cu ajutorul unui cilindru gradat (5.11). Se încălzește flaconul astupat la 50 °C ± 1 °C și se amestecă cu grijă până când PEDP se dizolvă. Flaconul se răcește la 20 °C, se completează până la volum cu metanol (4.2.1) și se amestecă prin răsturnare

7.3.2.   Se pipetează 1 ml (5.3) din această soluție într-un flacon gradat de 100 ml (5.6) și se completează până la volum cu metanol (4.2.1). Se pipetează 1 ml (5.3) din această soluție într-un flacon gradat de 10 ml (5.6), se adaugă 100 μl (5.7) de soluție de triptamină de 0,15 mM (7.1) și se completează până la volum cu metanol (4.2.1). Se amestecă prin răsturnare

Notă: Soluția conținând proba de referință se depozitează la 4 °C până la efectuarea analizei HPLC.

7.4.   Prepararea reactivului de derivare

Se cântăresc 25,0 ± 0,1 mg de OPA (4.3.4) într-un flacon gradat de 10 ml (5.6), se adaugă 0,5 ml (5.5) de metanol (4.2.1) și se amestecă cu grijă pentru ca OPA să se dizolve. Se completează până la marcaj cu soluție de acid boric (4.3.2) și se adaugă 20 μl de 2-mercaptoetanol (4.3.3) cu o seringă (5.7).

Notă: Reactivul de derivare se depozitează la 4 °C într-o fiolă de sticlă maro și este stabil timp de o săptămână.

7.5.   Determinarea prin HPLC

7.5.1.   Solvenți de eluție (4.4)

Solventul A: Soluție de fosfat diacid de sodiu 0,3 mM și soluție de acetat de sodiu 3 mM (ajustată cu acid acetic până la pH 6,5 ± 0,1): metanol: tetrahidrofuran = 558:440:2 (V/V/V)

Solventul B: metanol

7.5.2.   Gradient de eluare recomandat:

Notă: Este posibil ca gradientul de eluție să necesite o ușoară modificare pentru a se obține rezoluția prezentată în figura 1.

Temperatura coloanei: 30 °C.

7.5.3.   Volumul de injectare: 50 μl reactiv de derivare și 50 μl soluție conținând proba.

7.5.4.   Echilibrarea coloanei

Se pornește sistemul în fiecare zi, se irigă coloana cu solvent B 100 % timp de 15 minute, apoi se reglează la A:B = 40:60 și se echilibrează la 1 ml/min timp de 15 minute. Se efectuează o funcționare de probă prin injectarea de metanol (4.2.1).

Notă: Înainte de o depozitare pe termen lung, coloana se irigă cu metanol: cloroform = 80:20 (V/V) timp de 30 de minute.

7.5.5.   Determinarea conținutului de PS + PE din proba de testat

7.5.6.   Secvența de analize cromatografice se efectuează păstrând constantă perioada între efectuări pentru a se obține timpi de reținere constanți. Soluția-standard externă (7.3) se injectează la fiecare 5-10 soluții conținând proba de testat pentru a se calcula factorul de răspuns

Notă: Coloana se curăță prin irigare cu solvent B 100 % (7.5.1) timp de cel puțin 30 de minute la fiecare 20-25 de funcționări.

7.6.   Modul de integrare

7.6.1.   Vârful PEDP

PEDP este eluat ca un singur vârf. Se determină aria vârfului prin integrare depresiune-la-depresiune.

7.6.2.   Vârful triptaminei

Triptamina este eluată ca un singur vârf (figura 1). Se determină aria vârfului prin integrare depresiune-la-depresiune.

7.6.3.   Grupurile de vârfuri ale PS și PE

În condițiile descrise (figura 1), PS eluează sub forma a două vârfuri principale parțial incomplete precedate de un vârf minor. PE eluează sub forma a trei vârfuri principale parțial incomplete. Se determină întreaga arie a fiecărui grup de vârfuri stabilindu-se linia de bază ca în figura 1.

8.   CALCULAREA ȘI EXPRIMAREA REZULTATELOR

Conținutul de PS și PE din proba de testat se calculează după cum urmează:

C = 55,36 × [(A₂)/(A₁)] × [(T₁)/(T₂)]

unde:

9.   PRECIZIA METODEI

Notă: Valorile repetabilității au fost calculate conform Standardului Internațional IDF (*).

9.1.   Repetabilitatea

Derivația standard relativă a repetabilității, care exprimă variabilitatea rezultatelor analitice independente obținute de același operator utilizând aceeași aparatură în aceleași condiții pe aceeași probe de testat și într-un interval de timp scurt nu trebuie să depășească 2 % relativ. În cazul în care se obțin două determinări în aceste condiții, diferența relativă dintre cele două rezultate nu trebuie să fie mai mare de 6 % din media aritmetică a rezultatelor.

9.2.   Reproductibilitatea

În cazul în care se obțin două determinări de către operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită în condiții diferite pentru analizarea aceleiași probe de testat, diferența relativă dintre cele două rezultate nu trebuie să fie mai mare de 11 % din media aritmetică a rezultatelor.

10.   REFERINȚE

10.1.   Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., „Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids”. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).

Figura 1

Profilul HPLC al derivaților OPA ai fosfatidilserinei (PS) și ai fosfatidiletanolaminei (PE) în extractul de metanol al laptelui praf degresat reconstituit. Se raportează modul de integrare a vârfurilor PS, PE și al triptaminei (standard intern)

Apendicele II

DETECTAREA ZERULUI ÎNCHEGAT DIN LAPTELE PRAF DEGRESAT DESTINAT DEPOZITĂRII PUBLICE PRIN DETERMINAREA CAZEINMACROPEPTIDELOR PRIN CROMATOGRAFIE ÎN MEDIU LICHID DE ÎNALTĂ PERFORMANȚĂ (HPLC)

1.   OBIECT ȘI DOMENIU DE APLICARE

Această metodă permite detectarea zerului închegat din laptele praf degresat destinat depozitării publice prin determinarea cazeinmacropeptidelor.

2.   REFERINȚĂ

Standardul internațional ISO 707 – Lapte și produse lactate – Orientări privind prelevarea de probe.

3.   DEFINIȚIE

Conținutul de materii solide compuse din zer închegat se definește ca procent masic, astfel cum este determinat de conținutul de cazeinmacropeptide prin procedura descrisă.

4.   PRINCIPIU

5.   REACTIVI

Toți reactivii sunt de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puțin echivalentă.

5.1.   Soluție de acid tricloracetic

Se dizolvă 240 g de acid tricloracetic (CCl₃COOH) în apă și se completează până la 1 000 ml. Soluția trebuie să fie limpede și incoloră.

5.2.   Soluția-eluent, pH 6,0

Se dizolvă 1,74 g de fosfat acid de potasiu (K₂HPO₄), 12,37 g de fosfat diacid de potasiu (KH₂PO₄) și 21,41 g de sulfat de sodiu (Na₂SO₄) în aproximativ 700 ml de apă. În cazul în care este necesar, se ajustează până la pH 6,0 cu ajutorul unei soluții de acid fosforic sau de hidroxid de potasiu.

Se completează până la 1 000 ml cu apă și se omogenizează.

Notă: Compoziția eluentului poate fi actualizată pentru se conforma certificatului standardelor sau recomandărilor producătorului materialului de umplere a coloanei.

Soluția-eluent se filtrează înainte de utilizare printr-o membrană filtrantă având pori cu diametrul de 0,45 μm.

5.3.   Solvent de irigare

Se amestecă un volum de acetonitril (CH₃CN) cu nouă volume de apă. Amestecul se filtrează înainte de utilizare printr-o membrană filtrantă având pori cu diametrul de 0,45 μm.

Notă: Se poate utiliza orice alt solvent de irigare cu efect bactericid care nu scade eficiența rezoluției coloanei.

5.4.   Probele-standard

5.4.1.   Lapte praf degresat care îndeplinește cerințele prezentului regulament (adică [0])

5.4.2.   Același lapte praf degresat, modificat cu 5 % (m/m) zer închegat praf cu compoziție standard (adică [5]).

6.   APARATURĂ

6.1.   Cântar analitic

6.2.   Opțional, centrifugă capabilă să atingă o forță de centrifugare de 2 200 g, prevăzută cu tuburi de centrifugare astupate, cu o capacitate de aproximativ 50 ml

6.3.   Agitator mecanic

6.4.   Agitator magnetic

6.5.   Coloane de sticlă, cu diametrul de aproximativ 7 cm

6.6.   Filtre de hârtie, cu filtrare medie, cu diametrul de aproximativ 12,5 cm

6.7.   Echipament de filtrare din sticlă prevăzut cu membrană filtrantă cu diametrul porilor de 0,45 μm

6.8.   Pipete gradate permițând dozarea a 10 ml (ISO 648, clasa A sau ISO/R 835) sau un sistem de dispersare capabil să furnizeze 10,0 ml în două minute

6.9.   Sistem de dispersare capabil să furnizeze 20,0 ml de apă la o temperatură de aproximativ 50 °C

6.10.   Baie de apă termostatică, reglată la 25 ± 0,5 °C

6.11.   Echipament pentru HPLC, format din:

7.   PRELEVAREA PROBELOR

7.1.   Prelevarea probelor se face în conformitate cu procedura prevăzută în standardul internațional ISO 707. Totuși, statele membre pot utiliza o altă metodă de prelevare a probelor, cu condiția ca aceasta să fie conformă cu principiile standardului menționat anterior

7.2.   Probele se depozitează în condiții care împiedică orice deteriorare sau modificare a compoziției

8.   PROCEDURA

8.1.   Pregătirea probei de testat

Se transferă laptele praf într-un recipient cu o capacitate aproximativ dublă față de volumul laptelui praf, prevăzut cu un capac etanș pentru aer. Recipientul se închide imediat. Laptele praf se amestecă bine prin răsturnări repetate ale recipientului.

8.2.   Porția de testat

Se cântăresc 2,000 + 0,001 g din proba de testat într-un tub de centrifugare (6.2.) sau într-un flacon astupat în mod corespunzător (50 ml).

8.3.   Îndepărtarea lipidelor și a proteinelor

8.3.1.   Se adaugă 20,0 ml de apă caldă (50 C) la porția de testat. Se dizolvă pudra agitându-se timp de cinci minute cu ajutorul unui agitator mecanic (6.3). Tubul se introduce în baia de apă (6.10) și se lasă să se echilibreze la 25 °C

8.3.2.   Se adaugă 10,0 ml de soluție de acid tricloracetic (5.1.) la aproximativ 25 °C în două minute, amestecându-se puternic cu ajutorul agitatorului magnetic (6.4). Tubul se introduce într-o baie de apă (6.10) și se lasă timp de 60 de minute

8.3.3.   Se centrifughează (6.2) timp de 10 minute la 2 200 g sau se filtrează printr-o hârtie (6.6), eliminându-se primii 5 ml de filtrat

8.4.   Determinarea cromatografică

8.4.1.   Se injectează 15-30 μl de supernatant sau filtrat (8.3.3) măsurate cu precizie în dispozitivul HPLC (6.11) funcționând la un debit de 1,0 ml de soluție-eluent (5.2) per minut

Nota 1. Se poate utiliza un alt debit, în funcție de diametrul intern al coloanelor utilizate sau de instrucțiunile producătorului coloanei.

Nota 2. Coloanele se clătesc cu apă în timpul fiecărei întreruperi. Soluția-eluent nu se lasă niciodată în coloane (5.2).

Înainte de orice întrerupere care durează mai mult de 24 de ore, coloanele se clătesc cu apă și apoi se spală cu soluție (5.3) timp de cel puțin trei ore la un debit de 0,2 ml per minut.

8.4.2.   Rezultatele analizei cromatografice a probei de testat [E] se obțin sub forma unei cromatograme în care fiecare vârf se identifică după timpul său de retenție RT, după cum urmează.

Alegerea coloanei (coloanelor) poate afecta în mod considerabil timpii de retenție ai fiecărui vârf.

Integratorul (6.11.6) calculează automat aria A a fiecărui vârf:

Este esențial să se examineze aspectul fiecărei cromatograme înainte de interpretarea cantitativă pentru a se detecta orice anomalii cauzate fie de funcționarea necorespunzătoare a aparaturii sau a coloanelor, fie de originea sau natura probei analizate.

În cazul în care există dubii, analiza se repetă.

8.5.   Calibrarea

8.5.1.   Probelor-standard (5.4) li se aplică cu exactitate procedura descrisă de la punctul 8.2 la punctul 8.4.2.

Se utilizează soluții proaspăt preparate, întrucât CMP se degradează într-un mediu tricloracetic de 8 %. Pierderea este estimată la 0,2 % per oră la 30 °C.

8.5.2.   Înainte de determinarea cromatografică a probelor, coloanele se condiționează prin injectarea repetată a probei-standard (5.4.2) în soluție (8.5.1) până când aria vârfului și timpul de retenție al acestuia pentru CMP sunt constante.

8.5.3.   Factorul de răspuns R se determină prin injectarea aceluiași volum de filtrați (8.5.1) utilizat și pentru probe

9.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

9.1.   Metodă de calcul și formule

9.1.1.   Calcularea factorilor de răspuns R:

unde:

unde:

9.1.2.   Calcularea ariei relative a vârfurilor probei [E]:

unde:

9.1.3.   Calcularea timpului relativ de retenție al vârfului III pentru proba [E]:

RRT_III[E] = (RT_III[E])/(RT_III[5])

unde:

9.1.4.   Experimentele au demonstrat că există o relație liniară între timpul relativ de retenție al vârfului III, adică RRT_III [E] și procentul de zer praf adăugat până la 10 %.

Incertitudinea permisă pentru valorile RRT_III este de ± 0,002.

În mod normal, valoarea RRT_III [0] deviază puțin de la 1,034. În funcție de starea coloanelor, valoarea se poate apropia de 1,000, dar întotdeauna trebuie să fie mai mare decât această valoare.

9.2.   Calcularea procentului de zer închegat praf din probă:

W = S_III[E] – [1, 3 + (S_III[0] – 0, 9)]

unde:

9.3.   Precizia procedurii

9.3.1.   Repetabilitatea

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate simultan sau în succesiune rapidă de către același analist utilizând aceeași aparatură pe material de testare identic nu trebuie să depășească 0,2 % m/m.

9.3.2.   Reproductibilitatea

Diferența dintre două rezultate singulare și independente, obținute în două laboratoare diferite cu material de testare identic nu trebuie să depășească 0,4 % m/m.

9.4.   Interpretare

9.4.1.   Se presupune că zerul este absent în cazul în care aria relativă a vârfului III, S_III [E] exprimată în grame de zer închegat per 100 g de produs este ≤ 2,0 + (S_III[0] – 0,9)

unde

9.4.2.   În cazul în care aria relativă a vârfului III, S_III [E] este > 2,0 + (S_III[0] – 0,9) și aria relativă a vârfului II, S_II [E] ≤ 160, se determină conținutul de zer închegat conform indicațiilor de la punctul 9.2.

9.4.3.   În cazul în care aria relativă a vârfului III, S_III [E] este > 2,0 + (S_III[0] – 0,9) și aria relativă a vârfului II, S_II [E] ≤ 160, se determină conținutul total de proteine (P %); apoi se examinează graficele 1 și 2.

9.4.3.1.   Datele obținute în urma analizei probelor de lapte praf degresat nemodificat cu un conținut total de proteine mare sunt reprezentate în graficele 1 și 2.

Linia continuă reprezintă regresia liniară, ai cărei coeficienți se calculează prin metoda celor mai mici pătrate.

Linia dreaptă punctată marchează limita superioară a ariei relative a vârfului III, cu probabilitatea ca aceasta să nu fie depășită în 90 % dintre cazuri.

Ecuațiile liniilor drepte punctate din graficele 1 și 2 sunt:

respectiv unde:

Aceste ecuații sunt echivalente cu cifra 1,3 menționate la punctul 9.2.

Diferența (T₁ și T₂) dintre aria relativă S_III [E] determinată și aria relativă S_III se calculează după cum urmează: T₁ = S_III[E] – [(0,376 P% – 10,7) + (S_III[0] – 0,9)]T₂ = S_III[E] – [(0,0123 S_II[E] + 0,93) + (S_III[0] – 0,9)]

Conținutul de zer închegat se calculează cu ajutorul formulei următoare: W = T₂ + 0,91

unde:

0,91 este distanța pe axa verticală dintre linia dreaptă continuă și linia dreaptă punctată.

Apendicele III

DETERMINAREA MATERIILOR SOLIDE COMPUSE DIN ZER ÎNCHEGAT ÎN LAPTELE PRAF DEGRESAT

1.   SCOP: DETECTAREA ADĂUGĂRII DE MATERI SOLIDE COMPUSE DIN ZER ÎNCHEGAT ÎN LAPTELE PRAF DEGRESAT

2.   REFERINȚE: STANDARDUL INTERNAȚIONAL ISO 707

3.   DEFINIȚIE

Conținutul de materii solide compuse din zer închegat este definit ca procentul masic astfel cum este determinat prin intermediul conținutului de cazeinmacropeptide prin procedura descrisă.

4.   PRINCIPIU

Probele sunt analizate pentru a determina cazeinmacropeptida A printr-o procedură care implică cromatografie în mediu lichid de înaltă performanță cu fază inversată (procedură HPLC). Evaluarea rezultatelor se face prin referire la probe-standard formate din lapte praf degresat care conțin sau nu un procent cunoscut de zer praf. Rezultatele mai mari de 1 % (m/m) indică prezența materiilor solide compuse din zer închegat.

5.   REACTIVI

Toți reactivii sunt de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puțin echivalentă. Acetonitrilul trebuie să fie de calitate spectroscopică sau de calitate HPLC.

5.1.   Soluție de acid tricloracetic

Se dizolvă 240 g de acid tricloracetic (CCl₃COOH) în apă și se completează până la 1 000 ml. Soluția trebuie să fie limpede și incoloră.

5.2.   Eluenții A și B

Eluentul A: Într-un flacon gradat de 1 000 ml se introduc 150 ml acetonitril (CH₃CN), 20 ml de izopropanol (CH₃CHOHCH₃) și 1,00 ml de acid trifluoracetic (TFA, CF₃COOH). Se completează cu apă până la 1 000 ml.

Eluentul B: Într-un flacon gradat de 1 000 ml se introduc 550 ml de acetonitril, 20 ml de izopropanol și 1,00 ml de TFA. Se completează cu apă până la 1 000 ml. Soluția-eluent se filtrează înainte de utilizare printr-o membrană filtrantă având pori cu diametrul de 0,45 μm.

5.3.   Conservarea coloanei

După analize, coloana se irigă cu eluentul B (prin intermediul unui gradient), iar apoi se irigă cu acetonitril (prin intermediul unui gradient, timp de 30 de minute). Coloana se păstrează în acetonitril.

5.4.   Probele-standard

5.4.1.   Lapte praf degresat care îndeplinește cerințele pentru depozitare publică [adică (0)].

5.4.2.   Același lapte praf degresat modificat cu 5 % (m/m) zer închegat praf cu compoziție standard (adică [5]).

5.4.3.   Același lapte praf degresat, modificat cu 50 % (m/m) zer închegat praf cu compoziție standard (adică [50]).

6.   APARATURĂ

6.1.   Cântar analitic

6.2.   Opțional, centrifugă capabilă să atingă o forță de centrifugare de 2 200 g, prevăzută cu tuburi de centrifugare astupate, cu o capacitate de aproximativ 50 ml

6.3.   Agitator mecanic

6.4.   Agitator magnetic

6.5.   Coloane de sticlă, cu diametrul de aproximativ 7 cm

6.6.   Filtre de hârtie, cu filtrare medie, cu diametrul de aproximativ 12,5 cm

6.7.   Echipament de filtrare din sticlă prevăzut cu membrană filtrantă cu diametrul porilor de 0,45 μm

6.8.   Pipete gradate, permițând dozarea a 10 ml (ISO 648, clasa A sau ISO/R 835) sau un sistem de dispersare capabil să furnizeze 10,0 ml în două minute

6.9.   Sistem de dispersare capabil să furnizeze 20,0 ml de apă la o temperatură de aproximativ 50 °C

6.10.   Baie de apă termostatică, reglată la 25 ± 0,5 °C

6.11.   Echipament pentru HPLC, format din:

7.   PRELEVAREA PROBELOR

7.1.   Prelevarea probelor se face în conformitate cu procedura prevăzută în standardul internațional ISO 707. Totuși, statele membre pot utiliza o altă metodă de prelevare a probelor, cu condiția ca aceasta să fie conformă cu principiile standardului menționat anterior

7.2.   Probele se depozitează în condiții care împiedică orice deteriorare sau modificare a compoziției.

8.   PROCEDURA

8.1.   Pregătirea probei de testat

Se transferă laptele praf într-un recipient cu o capacitate aproximativ dublă față de volumul laptelui praf, prevăzut cu un capac etanș pentru aer. Recipientul se închide imediat. Laptele praf se amestecă bine prin răsturnări repetate ale recipientului.

8.2.   Porția de testat

Se cântăresc 2,00 ± 0,001 g din proba de testat într-un tub de centrifugare (6.2.) sau într-un flacon adecvat astupat (50 ml).

Notă: În cazul amestecurilor, se cântărește o astfel de probă de testat încât porția conținând proba degresată să corespundă la 2,00 g.

8.3.   Îndepărtarea lipidelor și a proteinelor

8.3.1.   Se adaugă 20,0 ml de apă caldă (50 °C) la porția de testat. Se dizolvă pudra agitându-se timp de cinci minute cu ajutorul unui agitator mecanic (6.3). Tubul se introduce în baia de apă (6.10) și se lasă să se echilibreze la 25 °C

8.3.2.   Se adaugă 10,0 ml de soluție de acid tricloracetic la aproximativ 25 °C (5.1) în mod constant pe parcursul a două minute, în timp ce se amestecă energic cu ajutorul unui agitator magnetic (6.4). Tubul se introduce într-o baie de apă (6.10) și se lasă timp de 60 de minute

8.3.3.   Se centrifughează (6.2) 2 200 g timp de 10 minute sau se filtrează prin hârtie (6.6), eliminându-se primii 5 ml de filtrat.

8.4.   Determinarea cromatografică

8.4.1.   Metoda HPLC cu fază inversă exclude posibilitatea de a avea rezultate fals pozitive din cauza prezenței zarei praf acidulate.

8.4.2.   Înainte de efectuarea analizei HPLC cu fază inversă se optimizează condițiile de gradient. Pentru sistemele pe bază de gradient care au un volum mort de aproximativ 6 ml (volum de la punctul în care solvenții se întâlnesc până la volumul buclei injectorului, inclusiv) timpul de retenție de 26 ± 2 minute pentru CMP A este optim. Sistemele pe bază de gradient care au un volum mort mai mic (de ex. 2 ml) trebuie să utilizeze valoarea de 22 de minute ca timp optim de retenție

Se iau soluții din probele-standard (5.4) fără și cu zer închegat 50 %.

Se injectează 100 μl de supernatant sau de filtrat (8.3.3) în dispozitivul HPLC care funcționează în condițiile de gradient de explorare din tabelul 1.

Tabelul 1

Condițiile gradientului de explorare pentru optimizarea cromatografiei

Comparația celor două cromatograme trebuie să evidențieze localizarea vârfului CMP_A.

Utilizând formula redată mai jos, compoziția inițială a solventului de utilizat pentru gradientul normal (a se vedea 8.4.3) poate fi calculată % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RT_cmpA – 26) / 6)*30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RT_cmpA – 26) / 6)*1,11

Unde:

8.4.3.   Se iau soluțiile conținând probele de testat

Se injectează 100 μl de supernatant sau de filtrat (punctul 8.3.3) măsurat cu exactitate în dispozitivul HPLC care funcționează la un debit de 1,0 ml de soluție-eluent (5.2) per minut.

Compoziția eluentului la începutul analizei se obține de la 8.4.2. În mod normal este apropiată de A:B = 76:24 (5.2). Imediat după injectare se pornește un gradient liniar, rezultatul fiind un procent al B cu 5 % mai mare după 27 de minute. Ulterior, se pornește un gradient liniar care aduce compoziția eluentului la 90 % B în cinci minute. Această compoziție este menținută timp de cinci minute, după care compoziția este modificată cu ajutorul unui gradient liniar în decurs de cinci minute până se ajunge la compoziția inițială. În funcție de volumul intern al sistemului de pompare, următoarea injectare se poate face la 15 minute după ce se obțin condițiile inițiale.

Nota 1. Timpul de retenție al CMP_A trebuie să fie de 26 ± 2 minute. Acesta se poate obține prin modificarea condițiilor inițiale și finale ale primului gradient. Totuși, diferența la nivelul % B pentru condițiile inițiale și finale ale primului gradient trebuie să se mențină la valoare de 5 % B.

Nota 2. Eluenții trebuie degazați suficient și trebuie, de asemenea, să rămână degazați. Acest aspect este esențial pentru buna funcționare a sistemului de pompare pe bază de gradient. Deviația standard a timpului de retenție al vârfului CMP_A trebuie să fie sub 0,1 minute (n = 10).

Nota 3. La fiecare cinci probe se injectează proba de referință [5] și se utilizează pentru calcularea unui nou factor de răspuns R. (9.1.1).

8.4.4.   Rezultatele analizei cromatografice a probei de testat (E) se obțin sub forma unei cromatograme în care vârful CMP_A este identificat prin timpul său de retenție de aproximativ 26 de minute

Integratorul (6.11.6) calculează automat înălțimea vârfului H a vârfului CMP_A. Se verifică poziția liniei de bază în fiecare cromatogramă. În cazul în care poziția liniei de bază este incorect localizată, analiza sau integrarea se repetă.

Notă: În cazul în care vârful CMP_A este suficient de separat de alte vârfuri, se utilizează alocarea liniei de bază depresiune-la-depresiune, altminteri se utilizează perpendiculare verticale până la o linie de bază comună, care trebuie să aibă punctul de plecare aproape de vârful CMP_A (deci, nu la t = 0 min!). Pentru standard și pentru probe se utilizează același tip de integrare, iar în cazul utilizării liniei de bază comune se verifică coerența acesteia pentru probe și standard.

Este esențial să se examineze aspectul fiecărei cromatograme înainte de interpretarea cantitativă pentru a se detecta orice anomalii cauzate fie de funcționarea necorespunzătoare a aparaturii sau a coloanei, fie de originea sau natura probei analizate. În cazul în care există dubii, analiza se repetă.

8.5.   Calibrarea

8.5.1.   Se aplică cu exactitate procedura descrisă de la punctul 8.2 la punctul 8.4.4 utilizând probele-standard (5.4.1-5.4.2). Se utilizează soluții proaspăt preparate, deoarece CMP se degradează într-un mediu de acid tricloracetic 8 % la temperatura camerei. La 4 °C, soluția rămâne stabilă timp de 24 ore. În cazul seriilor lungi de analize este preferabil ca în injectorul automat să se utilizeze o tavă cu probe răcită.

Notă: 8.4.2. se poate omite în cazul în care % B în condițiile inițiale este cunoscut din analizele efectuate anterior.

Cromatograma probei de referință [5] trebuie să fie analoagă cu cea din Figura 1. În această figură, vârful CMP_A este precedat de două vârfuri mici. Este esențial să se obțină o separare similară.

8.5.2.   Înainte de determinarea cromatografică a probelor se injectează 100 μl din proba-standard care nu conține zer închegat [0] (5.4.1).

Pe cromatogramă nu trebuie să apară un vârf la timpul de retenție al vârfului CMP_A.

8.5.3.   Factorul de răspuns R se determină prin injectarea aceluiași volum de filtrat (8.5.1) ca și cel utilizat pentru probe.

9.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

9.1.   Metodă de calcul și formule

9.1.1.   Calcularea factorului de răspuns R:

Vârful CMP_A: R = W/H

Unde:

9.2.   Calcularea procentului de zer închegat praf din probă

W(E) = R × H(E)

Unde:

În cazul în care W(E) este mai mare de 1 % și diferența dintre timpul de retenție și cel al probei-standard (5) este mai mică de 0,2 minute, atunci sunt prezente materii solide compuse din zer închegat.

9.3.   Precizia procedurii

9.3.1.   Repetabilitatea

Diferența dintre rezultatele a două determinări efectuate simultan sau în succesiune rapidă de către același analist utilizând aceeași aparatură pe material de testare identic nu trebuie să depășească 0,2 % m/m.

9.3.2.   Reproductibilitatea

Nu s-a determinat.

9.3.3.   Liniaritate

De la 0 la 16 % zer închegat trebuie să se obțină o relație liniară cu un coeficient de corelare > 0,99.

9.4.   Interpretare

Limita de 1 % include incertitudinea cauzată de reproductibilitate.

Figura 1

Ni—4.6 standard